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前言Hello小伙伴们大家好，我是生信技能树的小学徒”我才不吃蛋黄“。今天是胃癌单细胞数据集GSE163558复现系列第三期。第二期我们走了Seurat V5标准流程，利用harmony整合去批次后，按标准流程进行了降维聚类分群。本期，我们将在第二期基础上选择合适的分辨率，对细胞亚群进行注释。
1背景介绍Bulk转录组的诞生，使我们能够快速的获取组织和细胞大量的RNA-seq数据。相较于传统的RNA检测方法（pcr），这种高通量测序手段更高效，数据维度更高，数据量更大。但是，组织中包含有各种不同类型的细胞，如肿瘤组织中除了肿瘤细胞，还有正常上皮细胞、免疫细胞、成纤维细胞等等。Bulk转录组（组织）的最大缺陷在于我们获取到的RNA-seq数据反映的是不同类型细胞平均的RNA水平，因此掩盖了部分细胞表达特征。单细胞转录组测序（scRNA-seq）则很好的弥补了这一缺陷，它在单个细胞水平上构建每个细胞的基因表达谱。
在第二期，我们最终获取到了45548个细胞的RNA-seq数据。我们需要弄清楚这45548个细胞分别是哪种类型，挨个细胞鉴别显然不太现实。我们对细胞进行了降维聚类分群，每一群的细胞具有相似的特征，可以粗略的将其归类为同一类细胞（细致的话需要再次降维聚类分群后分亚群，后续有推文会专门介绍，敬请关注）。每一群细胞都有特征的表达基因，我们可以根据这些特征基因将这群细胞归类为某一类型，这一过程被称为“细胞类型注释”。
通常我们第一层次降维聚类分群，会将细胞划分为三大类，分别是
immune (CD45+,PTPRC)epithelial/cancer (EpCAM+,EPCAM)stromal (CD10+,MME,fibro or CD31+,PECAM1,endo)常见的细胞群的maker基因分别是：上皮细胞（EPCAM、KRT19、CLDN4）、基质（PECAM1、CLO1A2、VWF）、增殖性（MKI67、STMN1、PCNA）、T（CD3D、CD3E、CD2）、B（CD79A，IGHG1，庄闲和MS4A1），NK（KLRD1、GNLY、KLRF1）和髓系（CSF1R、CSF3R、CD68）细胞。
原文中也有提供分群maker：
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2细胞类型注释选择分辨率
建站客服QQ：88888888在第二期中细胞分群时我们可以看到，分辨率设置越高，分群数量越多。
Tree_diff_resolution
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在这里，我们选择0.5分辨率。rm(list=ls())sce.all.int = readRDS('2-harmony/sce.all_int.rds') sel.clust = "RNA_snn_res.0.5"sce.all.int <- SetIdent(sce.all.int, value = sel.clust)table(sce.all.int@active.ident) colnames(sce.all.int@meta.data) 图片
{jz:field.toptypename/}此时，细胞分为了14群。接着，我们在此工作目录下创建了新的文件夹”3-Celltype“。
dir.create("./3-Celltype")setwd("./3-Celltype")scRNA=sce.all.int绘制气泡图展示maker基因在各分群的表达：
genes_to_check = c('EPCAM','KRT19','CLDN4', #上皮 'PECAM1' , 'CLO1A2', 'VWF', #基质 'CD3D', 'CD3E', 'CD8A', 'CD4','CD2', #T 'CDH5', 'PECAM1', 'VWF', #内皮 'LUM' , 'FGF7', 'MME', #成纤维 'AIF1', 'C1QC','C1QB','LYZ', #巨噬 'MKI67', 'STMN1', 'PCNA', #增殖 'CPA3' ,'CST3', 'KIT', 'TPSAB1','TPSB2',#肥大 'GOS2', 'S100A9','S100A8','CXCL8', #中性粒细胞 'KLRD1', 'GNLY', 'KLRF1','AREG', 'XCL2','HSPA6', #NK 'MS4A1','CD19', 'CD79A','IGHG1','MZB1', 'SDC1', #B 'CSF1R', 'CSF3R', 'CD68') #髓系p = DotPlot(scRNA, features = unique(genes_to_check), assay='RNA' ) + coord_flip()pDotPlot
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再次查看分群TSNE图：
mycolors <-c('#E64A35','#4DBBD4' ,'#01A187' ,'#6BD66B','#3C5588' ,'#F29F80' , '#8491B6','#91D0C1','#7F5F48','#AF9E85','#4F4FFF','#CE3D33', '#739B57','#EFE685','#446983','#BB6239','#5DB1DC','#7F2268','#800202','#D8D8CD')tsne =DimPlot(scRNA, reduction = "tsne",cols = mycolors,pt.size = 0.8, group.by = "RNA_snn_res.0.5",label = T,label.box = T)tsneTSNE
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结合DotPlot和TSNE图给各细胞群命名：
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####细胞生物学命名celltype=data.frame(ClusterID=0:13, celltype= 0:13)
这里强烈依赖于生物学背景，看dotplot的基因表达量情况来人工审查单细胞亚群名字。
celltype[celltype$ClusterID %in% c( 4,6,13),2]='Myeloid'celltype[celltype$ClusterID %in% c( 5,11,12 ),2]='Epithelial'celltype[celltype$ClusterID %in% c(0,1),2]='T'celltype[celltype$ClusterID %in% c( 8 ),2]='Fibro'celltype[celltype$ClusterID %in% c( 9 ),2]='Proliferative'celltype[celltype$ClusterID %in% c(3,7 ),2]='B'celltype[celltype$ClusterID %in% c( 2 ),2]='NK'celltype[celltype$ClusterID %in% c( 10 ),2]='endothelial'
然后将细胞类型信息添加到meta.data：
scRNA@meta.data$celltype = "NA"for(i in 1:nrow(celltype)){ scRNA@meta.data[which(scRNA@meta.data$RNA_snn_res.0.5 == celltype$ClusterID[i]),'celltype'] <- celltype$celltype[i]}table(scRNA@meta.data$celltype)查看不同类型细胞的数量：
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可视化细胞类型：
th=theme(axis.text.x = element_text(angle = 45, vjust = 0.5, hjust=0.5)) library(patchwork)celltype_tsne =DimPlot(scRNA, reduction = "tsne",cols = mycolors,pt.size = 1, group.by = "celltype",label = T)celltype_tsne
celltype_tsne
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综合看样本类型、患者、细胞类型TSNE图：
sample_tsne =DimPlot(scRNA, reduction = "tsne",cols = mycolors,pt.size = 0.2, group.by = "sample") patient_tsne =DimPlot(scRNA, reduction = "tsne",cols = mycolors,pt.size = 0.2, group.by = "patient") sample_tsne + patient_tsne+celltype_tsne
sample_tsne + patient_tsne+celltype_tsne
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保存rds对象：
saveRDS(scRNA, "sce_celltype.rds")3结语
本期，我们选择resolution=0.5对细胞进行了手工分群注释。细胞注释的方式有很多，详情请参照单细胞天地前期推文：单细胞测序最好的教程（六）：细胞类型注释。在本系列后续推文“细胞亚群细分”中，我们还将使用singleR自动注释，并与手工注释对比，干货满满，敬请期待。下一期，我们将在本期基础上对细胞类型及基因进行可视化，使用DimPlot，FeaturePlot，ggplot，DoHeatmap等绘制多类型图，使你的Figure更精致，欢迎大家持续追更，谢谢！
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